紅葉石楠(Photinia×fraseri‘Red Robin’)是起源于亞熱帶的常綠灌木樹種,是重要的園林觀賞樹種,被譽為“紅葉綠籬之王”。由泰安市泰山林業科學研究院主持承擔的“紅葉石楠良種選育及沙冬青抗寒基因克隆與新種質創制”項目,針對我國園林綠化樹種不適應北方冬季的寒冷氣候,容易造成凍害的情形,自2001年開始對紅葉石楠進行引種試驗,同時與中國科學院遺傳發育生物學研究所合作,開展對林木抗寒基因的克隆和遺傳轉化的研究。研究人員通過良種選育、克隆木本植物沙冬青抗寒基因(AmEBP1和AmGS),利用根癌農桿菌介導遺傳轉化,將AmGS基因導入珍貴園林綠化樹種紅葉石楠中,開辟了利用高新技術培育抗寒林木新種質的新途徑。項目2009年得到山東省科技攻關項目資助,主要完成人有王迎、孫海偉、黃艷艷、羅磊、孔令剛等。
1.選育了“魯賓斯”紅葉石楠抗寒良種。從引種馴化紅葉石楠變異群體中初選出多年在泰安從未受過嚴重凍害植株80株,經對比試驗,篩選出山東泰安自然條件下越冬枝葉,凍害死亡率平均在10%以下,整株沒有死亡現象;春天從3月8號開始萌動,較對照提早6天;整個品種在自然生長狀況下的紅葉期為168天,較對照延長了13天。利用一年生枝條,扦插平均生根率92%,雙舌接成活率達78%,劈接成活率為62%。2008年通過山東省林木良種審定魯S-ETS-PG-011-2008,定名為“魯賓斯”紅葉石楠。
2.采用分子克隆方法(cDNA-AFLP 和RACE)在國際上率先從沙冬青中克隆出了木本植物抗寒基因AmEBP1和AmGS,有關論文已發表在Plant Molecular Biology、Preparative Biochemistry & Biotechnology和Gene上。
3.建立了高效紅葉石楠再生體系和高效基因轉化技術體系;對轉基因株系進行了PCR、Southern、RT-PCR分析,證實AmGS基因已經整合到轉基因紅葉石楠基因組DNA中,且在轉錄水平表達;對轉基因株系連續6次扦插繼代植株進行了PCR測定,導入的AmGS基因在繼代植株中能夠穩定地傳遞下去。
4.通過對轉基因株系與未轉基因株系抗寒性及生理對比檢測,獲得了4個抗寒性明顯提高的轉基因組培苗株系(R3, R5, R6,R7)。它們的株LT50都明顯低于未轉基因對照植株(低4℃左右)。這些轉基因株系在冷凍條件下REC升高程度明顯低于未轉基因對照植株,SOD、POD活性、可溶性蛋白含量轉基因高于對照組。這些抗寒性相關生理指標的檢測結果表明,轉基因株系的抗寒能力有了提高。
5.經田間對比試驗,轉基因紅葉石楠在田間低溫下的冷害指數為2.833,較對照未轉基因提高97.7%;轉基因紅葉石楠在露天條件下能夠安全越冬,只有少部分的葉片和新稍發生凍害,越冬枝葉凍害率低于10%。轉基因紅葉石楠在試驗地立地條件下,生長性狀表現一致,抗逆性、觀賞性都表現出很強的優勢。
6.經對轉基因紅葉石楠根際的土壤微生物影響分析,轉基因紅葉石楠根際的細菌菌群數量變化最大,對微生物總體組成影響不大,以細菌數量最多,真菌和放線菌次之;在細菌菌群中以芽孢桿菌屬的細菌為主,未發現土壤中有AmGS基因漂移現象。
該項研究所獲得的抗寒紅葉石楠良種,經田間栽培后,可降低60%以上由于凍害所造成危害。2009年以來,山東省28個縣級以上城市已應用“魯賓斯”紅葉石楠12萬株,創造了經濟效益6000萬元以上。