重組膠原蛋白的產業發展歷程和生物醫學應用前景展望

傅容湛1 , 范代娣1,2 通訊作者fandaidi@nwu.edu.cn, 楊婉娟3 , 陳亮3 , 曲詞4 , 楊樹林5 , 徐麗明3 通訊作者xuliming@nifdc.org.cn

摘要：重組膠原蛋白作為天然動物組織膠原的替代物具有廣泛應用于生物材料、生物醫學等領域的潛力。種類繁多的重組膠原蛋白類型及其衍生體在多種表達系統中可實現一定規模的產業化生產，為探索和拓展重組膠原蛋白的臨床應用奠定了基礎。文中簡述了重組膠原蛋白的不同表達體系，如大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲、哺乳動物和人類細胞表達體系，重組膠原蛋白的優勢及潛在的應用和局限。著重介紹了目前重組膠原蛋白生產，包括不同表達體系的構建策略和重組膠原蛋白羥基化修飾等方面的研究進展，總結了重組膠原蛋白在生物醫藥領域的應用及應用基礎研究和應用前景展望。

關鍵詞：重組膠原蛋白 重組類人膠原蛋白 重組膠原蛋白變體 重組蛋白表達體系 生物醫學應用

Industrial development and biomedical application prospect of recombinant collagen

FU Rongzhan1 , FAN Daidi1,2 Corresponding authorfandaidi@nwu.edu.cn, YANG Wanjuan3 , CHEN Liang3 , QU Ci4 , YANG Shulin5 , XU Liming3 Corresponding authorxuliming@nifdc.org.cn

Abstract: Recombinant collagen, as an alternative to natural collagen, has the potential to be widely used in biomaterials, biomedicine, etc. Diverse recombinant collagens and their variants can be industrially produced in a variety of expression systems, which lays a foundation for exploring and expanding the clinical application of recombinant collagens. We reviewed different expression systems for recombinant collagens, such as prokaryotic expression systems, yeast expression systems, as well as plant, insect, mammal, and human cell expression systems, and introduced the advantages, potential applications, and limitations of recombinant collagen. In particularly, we focused on the current progress in the recombinant collagen production, including recombinant expression system construction and hydroxylation strategies of recombinant collagen, and summarized the current biomedical applications of recombinant collagen.

Keywords: recombinant collagen recombinant human-like collagen protein recombinant collagen variant recombinant protein expression system biomedical application

膠原(collagen) 是指作為細胞外基質的關鍵結構成分的一大類蛋白質，廣泛存在于所有組織和器官內，包括皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、軟骨和其他特定組織，為組織提供強度、耐久性和柔韌性^[1-2]。膠原蛋白因其優異的生物學功能、生物相容性和生物可降解等特性，成為生物材料和再生醫學等領域最廣泛使用的蛋白質材料之一，包括美容填充材料^[3]、藥物遞送系統^[4]、手術縫合和組織工程支架^[5-6]等。目前市面上廣泛使用的膠原材料主要是來源于動物組織提取獲得的各種不同類型膠原蛋白。 

大約30年前，研究人員開始使用重組DNA技術制備膠原蛋白的研究。在生物材料或生物醫學領域中，重組膠原蛋白已成為動物源膠原蛋白材料的一種有吸引力的替代方法。重組膠原蛋白是通過將膠原蛋白的天然基因序列或重新優化設計的基因序列，導入選定的宿主細胞中，如：大腸桿菌和酵母菌，經過培養、發酵、分離純化等工藝，獲得的具有一定天然膠原蛋白特征和主要功能的蛋白質。由于重組膠原蛋白分子單一、結構清晰、易于控制，因此在生物醫學及組織工程領域具有很好的潛在應用價值。此外，重組膠原蛋白技術可以用于無法從組織中規模獲取的膠原蛋白類型的大量生產及一些在其他動物群體(包括鳥類和海洋物種) 中存在的獨特膠原蛋白類型的生產^[7]。 

根據重組膠原蛋白研究策略，目前可分為3類：(1) 重組人膠原蛋白(recombinant human collagen protein)，是指由DNA重組技術制備的，含有人膠原蛋白特定類型基因編碼的全長(至少含有全部螺旋域) 或部分基因序列(至少含有螺旋域) 的重組蛋白，具有膠原蛋白理化性質和生物學功能，但非必須具有三螺旋結構；(2) 重組類人膠原蛋白(recombinant human- like collagen protein)，是指由DNA重組技術制備的，含有人特定類型或不同類型膠原蛋白基因編碼的部分序列，經基因編輯、組合、拼裝、剪輯等制備的人膠原蛋白類似物，具有蛋白質結構，可無或有三螺旋結構，具有膠原蛋白理化性質和生物學功能；(3) 重組類膠原蛋白(recombinant collagen-like protein)，是指由DNA重組技術制備的，含有人特定或不同類型膠原蛋白部分基因編碼及人工設計的基因編碼，經基因編輯、組合、拼裝等制備的膠原蛋白類似物，其基因編碼序列或氨基酸序列與人膠原蛋白的基因編碼序列或氨基酸序列同源性很低，但具有與膠原蛋白相似的理化性質和生物學功能。 

重組膠原表達體系的選擇對于成功制備在結構及性能上與生理性膠原蛋白類似的重組膠原蛋白至關重要。膠原蛋白的一些關鍵特征決定了其作為結構和細胞信號分子的特性，包括由特定類型α鏈組成的熱穩定三螺旋構象，α鏈的正確翻譯后修飾，前肽的正確加工以及形成超分子組裝體的能力。這些關鍵特征除了依賴于膠原蛋白的自組裝，還很大程度上依賴于重組膠原表達體系中多種膠原修飾酶的存在。因此，選擇具有所需膠原修飾酶的表達體系是成功制備生產重組膠原蛋白的關鍵。目前多種表達系統被用于制備各種類型膠原蛋白、膠原蛋白片段和修飾的膠原蛋白變體，促進了重組膠原蛋白產業長足發展。本文主要對重組膠原蛋白的產業發展歷程，包括各種表達體系的開發和潛在應用，以及亟待解決的問題進行綜述。 

1 重組膠原蛋白的表達體系

第一個用于制備重組膠原蛋白的表達體系是Fertala等^[8]嘗試的具有表達天然膠原蛋白修飾酶活性的哺乳動物細胞。該團隊所制備的重組Ⅰ型和Ⅱ型前膠原具有正常的熱穩定性，并且實現了正確的脯氨酸和賴氨酸殘基羥基化、正確的糖基化和前膠原N蛋白酶和C蛋白酶的加工；經過適當的修飾和酶促處理，這些天然的重組膠原蛋白能夠組裝成組織良好的原纖維。但較低的產率和高成本是哺乳動物細胞表達體系生產該類膠原蛋白的關鍵卡脖子問題，因此易于工業規模生產的表達體系得到了充分的研究和發展，主要包括細菌、酵母和昆蟲細胞。此外，研究人員還研究了在包括煙草、大麥和玉米在內的植物細胞，或在轉基因小鼠乳腺和轉基因雞的卵中制備重組膠原蛋白的可行性。表 1列舉了目前被使用的用于表達重組膠原蛋白的各種不同表達系統。 

表 1 不同表達系統制備的重組膠原蛋白

Expression system	Host cell	Collagen types	Hydroxylation	References
a. Expression systems containing endogenous proline-4-hydroxylase (P4H) activity
Cell culture	HT-1080	Type Ⅰα1 chain	Endogenous	[9]
	CHO cells	Type Ⅳ	Endogenous	[10]
	HEK293 cells	Type X	Endogenous	[11]
	Sf9 cells with baculovirus	Type Ⅰ	Endogenous	[12]
		Type Ⅱ	Enhance Endogenous	[13-14]
		Type Ⅲ	Endogenous	[15]
		Type Ⅸ	Enhance endogenous	[16]
		Type XIII	Endogenous	[17]
Transgenic animals	Mouse	Type Ⅰα1	Endogenous	[18]
		Type VII	Endogenous	[19]
	Silkworm	Type Ⅲ fragment	Enhance endogenous	[20]
b. Expression systems with no P4H activity
Transgenic plants	Tobacco	Type Ⅰα1	−	[21]
	Corn	Type Ⅰα1	−	[22]
	Barley	Type Ⅰα and type Ⅰα1 chain fragment	−	[23]
Micro organisms	E. coli	Type 2 CB8, CB10	−	[24]
		Type Ⅰ	−	[25]
		Type Ⅲα chain fragment	−	[26]
c. Expression systems with exogenous P4H activity
Transgenic plants	Tobacco	Type Ⅰα1	Exogenous	[21, 27]
	Maize seed	Type Ⅰα1	Exogenous	[28]
Micro organisms	P. pastoris	Type Ⅰ	Exogenous	[29-31]
		Type Ⅲ	Exogenous	[29, 32]
		Type Ⅱ	Exogenous	[33]
	S. cerevisiae	Type Ⅰ	Exogenous	[34-35]
	H. polymorpha	Recombinant gelatin	Exogenous	[36]
	E. coli	Type Ⅲ	Exogenous	[24, 37-38]

表選項

1.1 原核生物(大腸桿菌) 表達體系

大腸桿菌表達系統是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統，其遺傳背景清晰，發酵成本低、生產周期短、效率高，可以快速大規模生產外源蛋白，具備規模化生產外源蛋白的潛力。大腸桿菌已被成功用于表達多種重組類人膠原蛋白，常見載體包括pGE、pET系列，盡管所表達的膠原蛋通常缺乏羥基化，仍能表現出良好的熱穩定性^[39]。范代娣教授團隊^[25,38]利用大腸桿菌表達發酵獲得的不同類型的重組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白(Mr分別為97、110、130 kDa) 其最高產量達14 g/L，構建了不同類型和不同分子量的膠原蛋白分子庫。這些重組膠原蛋白已被用于研制人工血管、止血敷料、皮膚創傷修復材料、醫學美容、軟骨修復等醫學領域^[40-42]。。王皓^[43]在大腸桿菌系統中表達類人膠原蛋白基因COL6A2，重組類人膠原蛋白(Mr = 30 kDa) 表達量為34.2%。李瑛琦等^[26]構建大腸桿菌表達菌株表達類人Ⅲ型膠原蛋白，并發酵擴大培養提升類人Ⅲ型膠原蛋白(Mr = 13 kDa) 的產量可以達到3.02 g/L。楊霞^[44]報道采用大腸桿菌表達系統表達一種單鏈重組類人膠原蛋白，由人Ⅲ型膠原蛋白肽段作為基本重復單元(30個氨基酸殘基) 重復16次后連接人膠原蛋白Ⅱ型肽段(10個氨基酸殘基) 為末端，通過發酵實現制備，但產量未見相關報道。 

然而，大腸桿菌由于自身缺乏脯氨酸羥化酶，因此在單獨表達膠原蛋白時不能獲得羥基化的膠原蛋白，無法有效形成三螺旋結構，進而抑制天然結構膠原分子到膠原纖維的自組裝。細菌體系表達重組膠原蛋白存在的羥基化問題可以通過轉導羥化酶來解決。唐云平等^[24]將膠原蛋白部分編碼基因、人源脯氨酸羥化酶基因和D-阿拉伯糖-1, 4-內酯酶基因在大腸桿菌中共表達，獲得了羥化的類人膠原蛋白(Mr = 35 kDa)，脯氨酸殘基羥基化率超過10%，產量為0.26 g/L。Rutschman等^[37]在大腸桿菌中將人Ⅲ型部分膠原蛋白編碼基因(COL3A1) 與病毒來源的賴氨酰羥化酶L230基因和脯氨酸羥化酶L593基因共表達，制備獲得重組Ⅲ型類人膠原蛋白(Mr = 29 kDa) 具有與天然人膠原蛋白相似的羥基化水平，但由于其氨基酸序列與人膠原蛋白差異明顯，存在增加免疫原性風險。雖然在大腸桿菌中可獲得羥化的類人膠原蛋白，但產量普遍不高，為滿足市場上對膠原蛋白的需求還須不斷的探索與改進。 

1.2 真核生物表達體系

1.2.1 酵母表達體系

酵母表達體系因其易于遺傳修飾，且具有合成翻譯后修飾和蛋白質折疊所需酶的能力，理論上說也具有易高細胞密度發酵和低成本優勢等優點。迄今為止，利用酵母表達人膠原蛋白的研究較多，如畢赤酵母、漢遜酵母和釀酒酵母等，其中利用畢赤酵母工程菌表達獲得的重組人膠原蛋白的表達量和羥化效率最高。Myllyharju等^[29-30]將人Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原蛋白編碼基因整合到含脯氨酸羥化酶的畢赤酵母工程菌中，獲得的重組膠原蛋白均能被充分羥基化，且通過持續供氧使產量達到0.2−0.6 g/L，獲得的人Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原蛋白的分子量為116−200 kDa。FibroGen公司采用該技術生產重組類人Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白，并應用于止血劑^[38]和角膜再生材料^[39]商業化產品的研發。范代娣教授課題組^[31]在畢赤酵母GS115中實現了人Ⅰ型和Ⅲ型膠原α1鏈基因和脯氨酸-4-羥化酶基因共表達，實現羥化人Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(Mr = 130 kDa) (無N端前肽和C端前肽) 的高效生產，酵母體系重組膠原蛋白分別被用于研制創傷修復材料、注射凝膠類材料及軟骨修復類等醫學領域^[40-42]。徐立群^[45]表達了重組Ⅵ型膠原蛋白(Mr = 32 kDa)，為其活性功能的探討及其生產奠定基礎。楊樹林教授課題組^[32,46-47]以人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈編碼基因為模板，在畢赤酵母細胞中表達重組膠原蛋白(Mr = 55 kDa)，12.5 L發酵罐體系表達量為3.81 g/L。該團隊生產的高純度(> 99%) 重組膠原蛋白已在醫用生物材料及組織工程領域開展了諸如生物多孔海綿支架^[48]、敷料^[49]、醫用納米纖維膜^[50]及醫用水凝膠^[51]等產品的研發。李佳佳等^[33]和錢松等^[52]分別在畢赤酵母SMD1168中實現編碼人Ⅰ型膠原蛋白α1和Ⅱ型膠原蛋白α1鏈的優化基因的表達，實現了成熟全長的人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(Mr = 97.15 kDa) 和成熟全長Ⅱ型膠原蛋白α1鏈(Mr = 98.5 kDa) (均為包含N端前肽、三螺旋區域、C端前肽的成熟全長氨基酸序列) 的高效生產表達。侯增淼等^[53]基于人Ⅰ型膠原蛋白Gly-X-Y序列設計編碼親水性Gly-X-Y膠原肽段的核苷酸序列，構建類人膠原蛋白畢赤酵母工程菌，獲得表達量達4.5 g/L，純度大于95%的重組類人膠原蛋白(Mr = 38 kDa)。總體而言，重組膠原蛋白能夠通過與脯氨酸-羥化酶在畢赤酵母中共表達實現充分的羥基化，且隨著發酵產量的逐步提高，具備了工業化生產前景。釀酒酵母也被許多人用來生產重組膠原蛋白。Chan等^35]設計了含有脯氨酰羥化酶的釀酒酵母可制備Ⅲ型膠原蛋白(Mr = 190和270 kDa)，但脯氨酸羥基化水平約0.5%，顯著低于天然人膠原蛋白。Vaughn等^[54]采用不同的克隆策略提升了Ⅲ型膠原蛋白(Mr = 30和60 kDa) 的羥基化水平，但仍低于天然膠原蛋白。 

雖然酵母重組人膠原蛋白與天然人膠原蛋白相似度更高，但多為同源三聚體。然而，相對更難表達的異源三聚體膠原，如人Ⅰ型膠原，由于其在組織中含量最高、被研究報道得最多，同時科學界對其性能安全性了解最清晰，因此在生物醫藥或組織工程等領域比同源三聚體膠原，如Ⅱ和Ⅲ型膠原，具有更廣泛的潛在應用前景。Toman等采用優化克隆表達脯氨酰羥化酶兩個亞單位的在釀酒酵母，成功制備人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈和α2鏈，其α1鏈和α2鏈比例與天然Ⅰ型膠原具有的比例(2︰1) 相似^[34]。Olsen等通過去除對于Ⅰ型膠原蛋白三螺旋結構非必需的N-和C-區域，提高釀酒酵母生產重組人Ⅰ型膠原蛋白的產量^[55]。 

1.2.2 植物表達體系的構建

重組膠原蛋白已經在幾種植物系統中被成功表達，如玉米(Zea mays) 和煙草植物(Nicotiana tabacum) 中的植物細胞^[21,27]，通過與羥基化酶共表達能夠產生重組Ⅰ型膠原同源三聚體(Mr = 70.0–120.0 kDa)，但通常存在著外源蛋白表達量低等問題。Merle等^[27]通過共表達人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈基因和嵌合的P4H基因至煙草植株，成功制備羥基化的同源三聚體重組Ⅰ膠原蛋白(Mr = 120.0 kDa)。這是第一次在煙草中運用瞬時表達技術，共表達動物細胞來源修飾酶，以提高植物中重組蛋白的質量。Eskelin等^[23]以大麥種子作為宿主，表達了人Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈(Mr = 45 kDa) 和4.5×104片段，其中4.5×104片段的產量達到150 g/ha，有商業應用前景。Stein等^[21]在煙葉中將人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈和α2鏈編碼基因、人源脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶基因進行共表達(Mr = 170.0 kDa)，產量為20 g/L，且羥脯氨酸和羥賴氨酸的含量分別為7.55%和0.74%，羥基化程度與天然人Ⅰ型膠原蛋白非常接近，該技術已被Collplant公司(耐斯茲敖那，以色列) 用來商業化生產重組Ⅰ型人膠原蛋白用于臨床應用的產品中，據報道用于傷口敷料凝膠(VergenixFG) ^[56-58]和用于肌腱治療相關材料(VergenixSTR) 中^[59]。 

1.2.3 昆蟲表達系統

昆蟲桿狀病毒表達載體系統(baculovirus expression vector systems, BEVS) 由桿狀病毒表達載體和病毒感染的昆蟲宿主組成的二元表達系統，由于其可以對真核蛋白進行翻譯后加工等過程而被廣泛地用于真核基因的體外表達。而且昆蟲是桿狀病毒的自然宿主，不會感染其他動物、植物及人類，具有較高的安全性。Nokelainen等^[13]構建了兩株桿狀病毒表達系統，其中一株編碼Ⅱ型膠原α鏈，另一株編碼人P4H的α和β亞基，共轉染昆蟲細胞后，成功表達了具有穩定三螺旋結構的人Ⅱ型膠原蛋白(Mr = 120.0 kDa)，表達量達50 mg/L。齊琦等^[14]研究了利用重組桿狀病毒多基因表達系統高效表達人Ⅱ型膠原蛋白全序列。利用重組病毒BmNPV-ColⅡ-IM注射5齡起家蠶幼蟲，得到的重組人Ⅱ型膠原蛋白(Mr = 300.0 kDa) 可高達約1 mg/頭。但是，昆蟲桿狀病毒表達系統也存在著一定的缺陷，例如無法連續表達異源蛋白，無法產生復雜的糖基側鏈。分離的昆蟲細胞也被用作重組膠原蛋白表達系統，如由甘藍夜蛾(Trichoplusia ni) 獲得的克隆High Five^TM (HF) 昆蟲細胞。在沒有重組脯氨酸-羥化酶P4H的情況下，HF細胞能夠表達含4-羥基脯氨酸的重組人Ⅲ型膠原蛋白，但熱穩定性較低。添加重組脯氨酸-羥化酶P4H或在培養基中添加抗壞血酸均可提升膠原的羥基化水平和熱穩定性^[16]。 

Tomita等^[15]構建了膠原蛋白表達載體，并采用基因植入方法，通過轉基因蠶的絲腺分泌表達人Ⅲ型膠原蛋白片段(Mr = 53、75和88 kDa)，長度約為天然人Ⅲ型膠原蛋白全長的1/5，含量約為占蠶繭干重的1%，且脯氨酸羥基化不充分。Adachi等^[20]采用多基因共表達技術實現Ⅰ型膠原蛋白α1鏈和高活力脯氨酸羥基化酶P4H的共表達，轉基因蠶的P4H活力是野生型的130倍，利用轉基因蠶的中部絲腺分泌表達人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈，表達量提高到蠶繭干重的8%，但所表達的人Ⅰ型膠原蛋白鏈(Mr = 120.0 kDa) 缺乏羥脯氨酸，不能形成三螺旋結構。 

1.2.4 哺乳動物或人細胞表達體系

利用現代分子生物學技術，重組DNA可以被導入受精卵整合到宿主基因組中，實現重組膠原蛋白在轉基因動物各組織和器官中的表達。John等^[60]在轉基因小鼠乳腺中表達了完全羥基化的重組膠原蛋白(Mr = 60 kDa)。Toman等^[18]在轉基因小鼠乳腺內成功表達了可分泌、可溶性、具有螺旋結構的人Ⅰ型原膠原同源三聚體(Mr = 160 kDa)，表達量高達8 mg/mL。Hou等^[19]]在中國倉鼠卵巢內表達人Ⅶ型膠原蛋白(Mr = 290 kDa)。多種人類細胞系，包括纖維肉瘤細胞(HT-1080) 和胚胎腎細胞(293- EBNA) 被成功用于制備重組人膠原蛋白Ⅰ型、Ⅴ型(Mr = 120和250 kDa) 和Ⅶ型(Mr = 290 kDa) ^[9,61-63]。然而，目前細胞表達體系制備重組膠原蛋白因產量低不能滿足工業規模生產的需求。而轉基因哺乳動物是重組人膠原蛋白可能的高產來源。 

2 重組膠原蛋白衍生體研究進展

重組膠原蛋白表達體系關鍵技術研究為生產具有修飾序列的定制重組膠原蛋白變體開辟了機會，如短膠原衍生肽。雖然目前商業應用主要集中于基于天然膠原蛋白編碼基因制備的重組膠原蛋白，但膠原蛋白衍生體因其具有定制特征，如熱穩定性和與特定配體相互作用能力，將來可能具有更明顯的優勢和廣泛的應用前景。 

膠原衍生肽的三螺旋結構通常不穩定(熱變性溫度Tm 30−60 ℃)，在體溫下會展開，因此需要采用多種技術來提高其穩定性。將膠原蛋白衍生序列與三螺旋穩定化Gly-Pro-Pro重復序列相接^[64-66]，或將目標肽與穩定序列雜交可維持其三螺旋結構^[67]；將膠原蛋白衍生序列與噬菌體T4纖維蛋白的foldon域片段相連^[68-69]，由于foldon域片段具有形成三聚體的天然能力，因此能夠有效地穩定由短膠原肽組裝形成的三螺旋結構。此外，研究人員還探索了與細菌衍生的三螺旋肽融合的短膠原蛋白樣片段的可能性。細菌衍生的三螺旋肽盡管不含羥脯氨酸殘基，但在高溫下仍可保持穩定的三重螺旋結構(熱變性溫度Tm約為89 ℃)。由于其較好的穩定性、生物相容性和大規模生產潛力，細菌膠原蛋白在某些生物醫學領域具有很好的應用前景。盡管上述方法顯著提升了短膠原片段的穩定性，但是非天然序列的存在可能導致材料獲得臨床批準變得更復雜，因此可基于短膠原片段設計正常長度的膠原蛋白樣結構，包含短天然域的串聯重復序列，或將短結構域連接到長度與天然膠原蛋白相匹配的分子中，并使其形成三螺旋結構的能力。小部分這類構造的材料能夠保留聚集為纖絲結構的能力，但大部分則無法有效形成適當的纖絲，其中一些材料的熱穩定性較低，這些都阻礙了其在組織工程中的應用^[70]。此外，雖然新的串聯重復膠原蛋白衍生體已被作為研究工具，用于定位膠原特異性受體的結合域，定義驅動原纖維形成的區域以及作為治療性細胞的遞送載體等，但目前尚未在臨床上應用^[71-73]。 

3 重組膠原蛋白的優勢及其在生物醫學領域的應用

3.1 重組膠原蛋白的優勢

重組膠原蛋白相比于傳統方法提取的動物源性膠原，水溶性更好，可加工性能更強，并且具有組分單一、制備過程可控、生產周期短等特征，產品品質也更容易控制。因此，重組膠原蛋白在生物材料和生物醫學等領域中具有廣泛的應用前景。重組膠原蛋白的優勢主要表現在：(1) 通過基因工程手段在不影響膠原蛋白功能的條件下增加其親水性氨基酸的含量，從而提高重組膠原蛋白的親水性，使它們在實際應用中，特別是組織工程材料構建過程中更易于使用。(2) 重組單鏈結構膠原具有更多的活性結合位點，即便是三螺旋結構的重組膠原蛋白也會比天然人組織膠原結構更為松散，暴露出更多生物活性區域，易于與細胞或其他生物活性分子間發生相互作用，在許多方面可能表現出更強的生物活性。例如，重組膠原蛋白具有更強的促成纖維細胞募集、粘附、增殖和遷移的能力，在皮膚修復及皮膚組織工程領域展現出更強的功能性；(3) 對于具有催化氧化反應特性的金屬離子如鐵、銅、汞、鎘，具有更強的螯合能力，從而發揮更優異的抗氧化特性、減少皮膚氧化損傷和美白的作用；(4) 強化了膠原蛋白富集血小板和凝血因子的能力，表現出更優異的止血與促傷口愈合能力^[74]。(5) 通過重組技術能夠實現膠原蛋白分子進行理性設計和改造，生產天然膠原蛋白的新變體，例如，具有更多數量或種類活性官能團的新膠原蛋白分子、具有多重復特定功能結構域的新膠原蛋白序列，以及基于膠原與其他類型分子(如生長因子) 的新嵌合構建體。針對特定應用需求實現膠原蛋白的理性設計和合成，進一步強化膠原蛋白的功能性，以適應食品、化妝品、生物材料等不同領域的應用需求。 

3.2 重組膠原蛋白的生物醫學應用

重組膠原蛋白已經被廣泛用于制備適用于不同用途的生物醫用材料，包括組織修復工程、藥物遞送和蛋白質替代療法等。通過運用多種制備方法，重組膠原蛋白及其片段被制成多種類型的3D材料，如多孔海綿、纖絲和膜等，以更好地支持細胞附著和生長。例如，引入化學交聯穩定膠原蛋白材料，使其可以在體溫下發揮作用；使用靜電紡絲和磁對準等多種技術形成膠原纖絲結構材料^[75-78]。范代娣團隊^[79-80]報道多種新型重組膠原蛋白水凝膠體系，應用于皮膚燒傷或慢性傷口治療的臨床研究，發現其治療效果顯著優于臨床使用的傳統材料，證明重組膠原蛋白材料對于傳統組織工程技術制備的臨床產品具有替代性。可注射溫敏型重組膠凝膠材料可以直接在受傷部位創建具有適當形狀的組織支架，同時還具有藥物、細胞輸送和可控釋放能力。例如，Confalonieri等采用一種市售的含有RGD序列的重組膠原蛋白肽構建微球材料，支持間充質細胞生長^[81]。。范代娣團隊設計開發出系列基于重組膠原蛋白的水凝膠材料應用于多種受損組織的修復與再生，包括皮膚^[42]、軟骨^[82-84]等。Yang等利用重組Ⅲ型膠原蛋白制備三維多孔支架及水凝膠材料已被應用于醫學組織工程領域的應用研究中^[85-86]。 

隨著新型支架材料制造技術的進一步發展，包括纖維排列電紡方法和3D打印技術等，使得構建有組織的支架材料以及包括細胞在內的組織狀生物打印結構成為可能^[87-89]。例如，楊樹林團隊采用靜電紡絲法構建重組Ⅲ型膠原蛋白醫用雙層人造血管^[90]及利用活體細胞3D打印技術制備人造眼角膜^[91]。但是，目前大多數重組膠原蛋白材料的研究主要在簡單地定義重組膠原蛋白的基本用途，缺少更深入的關于重組膠原蛋白的基礎結構特性、穩定性、異質性等質量研究和基于重組膠原蛋白醫療產品的功效機制及其臨床應用研究。 

3.3 重組膠原蛋白在蛋白質替代療法中的潛在應用

重組膠原蛋白可用于潛在的蛋白質替代療法，治療多種涉及遺傳或獲得性膠原缺陷等嚴重疾病，盡管這些疾病有非常高的異質性，沒有明確的基因型與表型的相關性，但大多數都是由于基因突變導致的膠原蛋白減少^[92]。迄今為止，膠原蛋白替代療法的研究大多集中在影響皮膚和腎臟基底膜的疾病上，Ⅶ型膠原蛋白主要針對皮膚底膜的疾病，Ⅳ型膠原蛋白主要針對腎臟基底膜的疾病^[19,93]。 

隱性營養不良大皰性表皮松解癥(recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB) 是一種因為基因突變產生了過早的終止密碼子，從而完全阻止膠原的生物合成，導致Ⅶ型膠原蛋白完全缺失引發的水皰性皮膚病。RDEB的進行性會導致皮膚過度損傷、疤痕、攣縮和手指融合，甚至可能發展為鱗狀細胞癌^[94]。迄今為止，研究人員已經測試了將正常Ⅶ型膠原蛋白引入患病組織的幾種方法：(1) 通過遞送編碼正常膠原蛋白Ⅶ鏈的COL7A1基因進行蛋白質替代療法；(2) 直接遞送重組膠原Ⅶ的蛋白^[95]。 

考慮到Ⅶ型膠原蛋白的直接遞送，Remington等^[96]將重組Ⅶ型膠原蛋白直接注射到Ⅶ型膠原蛋白缺陷小鼠的皮膚中，觀察到Ⅶ型膠原蛋白在真皮基底膜區域的特定部位蓄積并形成了膠原蛋白Ⅶ組裝體，即錨定纖維，但并未觀察到抗Ⅶ型膠原蛋白Ⅰ抗體的形成。另一項研究中，重組Ⅶ型膠原蛋白被注射到無Ⅶ型膠原蛋白的小鼠的血液中，與在小鼠皮內注射的結果一樣，外源重組Ⅶ型膠原蛋白能夠聚集在適當的組織位置，包括真皮與表皮的交界處、舌頭和食道^[19]。盡管已取得這些令人鼓舞的初步結果，但采用直接遞送重組Ⅶ型膠原蛋白以改善RDEB患者組織結構完整性的治療方案并未從實驗室的研究階段轉化到臨床應用中。Phoenix Tissue Repair公司開始了治療Ⅶ型膠原突變的RDEB患者的臨床試驗，以確定膠原蛋白替代療法的安全性和有效性^[97]。如果成功可能也會為其他膠原類型突變引起的疾病使用替代療法提供可能性。 

目前蛋白質替代療法的發展仍然受許多問題制約。(1) 存在于溶液中的Ⅶ型膠原蛋白(人體中最大的已知蛋白質之一) 的斯托克斯半徑很大，因此，Ⅶ型膠原蛋白或其他膠原蛋白類型不可能輕易擴散到靶組織部位，并且高親和性Ⅶ型膠原蛋白間的結合作用加速了不希望的聚集現象。(2) Ⅶ型膠原蛋白必須通過自組裝形成功能性錨定纖維，這類復雜的過程不太可能在經皮或靜脈內注射遞送的外源性Ⅶ型膠原蛋白上發生。Supp等^[98]的最新研究也支持這一觀點：要使錨定纖維在真皮-表皮交界內正確形成并發揮功能，表皮角質形成細胞和真皮成纖維細胞都必須產生Ⅶ型膠原蛋白。(3) Ⅶ型膠原蛋白的半衰期。Kühl等^[99]證明Ⅶ型膠原蛋白的半衰期約為1個月，因此為取得有積極意義的長期作用必須頻繁地大量注射。(4) 靜脈注射Ⅶ型膠原蛋白的血小板聚集作用。盡管體內實驗表明，Ⅶ型膠原蛋白不像形成纖維的膠原蛋白那樣強烈聚集血小板，但不能排除血液中的膠原蛋白Ⅶ觸發血凝塊形成的可能性^[100]。。而且其他類型膠原蛋白的蛋白質替代療法在臨床應用時也可能會遇到類似問題。例如，通過局部或全身途徑輸送Ⅳ型膠原蛋白治療Alport綜合征^[96]，到目前為止仍未確定這種方法的有效性，也并未解決其引起的血小板聚集、擴散和激活等問題。 

重組膠原蛋白替代療法治療膠原基因突變引起的疾病時，治療時間的選擇是需要考慮的另一個關鍵因素。如果膠原蛋白是用于形成早期胚胎發育的組織模板，僅通過產后遞送重組膠原蛋白是否能夠在其靶組織恢復并維持功能尚不清楚。例如，在Ⅱ型膠原蛋白突變引起的脊椎骨骺發育不良的小鼠模型中，只有在胚胎早期干預才能恢復正常的骨骼組織。相反，在胚胎后期和產后干預則無法改善這些組織的病程^[101-102]。 

4 重組膠原蛋白臨床研究現狀及展望

盡管人們針對具有天然結構和膠原衍生結構的重組膠原蛋白已成功開發設計出多種生產系統，包括不同的生物，如細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母、轉基因動物和轉基因植物。但是所獲得的重組膠原蛋白到目前為止還僅限于少數產品在臨床上開始應用，主要的原因可能包括以下幾點。 

(1) 目前研發重組膠原蛋白的生產系統包括：細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母、轉基因動物和轉基因植物等，但由于制造技術的難度和膠原蛋白大分子結構的復雜性，使得能夠大規模生產重組膠原蛋白的企業，尤其是能規模制備滿足臨床需求品質的重組膠原的企業并不多。 

(2) 雖然可以通過重組技術生產不同類型膠原蛋白，這也是重組技術的最大優勢之一，目前重組技術能進行規模制備的膠原主要是單鏈結構膠原，單鏈結構膠原蛋白具有更靈活的自組裝形式及與細胞基質結合位點等優勢。這種組裝有些可逆有些不可逆，例如在某種溫度條件下觀測到單鏈重組膠原蛋白可呈現出生理膠原的光譜學性質，但升高或降低溫度這種性狀消失，范代娣團隊研發的一種重組膠原蛋白在溫度低于15 ℃時呈現6聚體纖維結構，升高溫度則自動解聚，長纖維變成短棒狀，在體內生理條件下也是一種單鏈結構，說明它是一種條件弱交聯組裝，而有的組裝是不可逆的，如在一些射線等作用下的組裝交聯，在解除條件后其理化性能仍然維持其強組裝不可逆性狀。正是由于重組膠原蛋白具有多種形式和活性結合位點的優勢，使以其為原料的組織工程醫療產品獲得令人鼓舞的臨床前結果^[81-82,103]。單鏈結構膠原因為非常好的可塑性、可加工性、可體外自組裝等使得它更優于已經組裝成天然高級結構的動物膠原蛋白，但缺點是發酵產生的單鏈結構膠原在純化及處于微生物復雜酶系時容易降解，所以純化成本居高不下。 

(3) 基于蛋白材料結構需求進而通過理性設計獲得膠原蛋白序列并進行重組表達生產，可以獲得一系列在安全性、功效性方面更好的類膠原衍生體，而這方面的臨床研究需要更嚴格的基礎研究數據及監管部門擔心的未知風險評價，因此導致了重組膠原家族臨床應用的慢進程。 

(4) 由于動物膠原易于從動物的組織中分離獲得，因此其產品價格比需要更先進技術生產的重組膠原蛋白具有優勢；因此動物膠原蛋白很可能仍會繼續為生物醫學、制藥、食品和化妝品等行業提供大量所需原料。 

(5) 組織工程產品是重組膠原蛋白材料的理想應用領域，但是，由于重組膠原蛋白可能在表達過程中存在異質型、非完全生理性人膠原結構或新結構蛋白等，如不同類型的異質性或程度及是否會影響或者多大程度地影響產品的結構穩定性和功能等都需要全面的質量評價和風險評估。而對于一些特殊用途必須需要制備成天然結構膠原蛋白時，重組膠原蛋白的應用將受限于其翻譯后修飾水平低、糖基化、羥基化程度不高等限制。相信隨著合成生物學、蛋白質工程技術等的快速發展，探索膠原蛋白高效合成路徑和特定修飾關鍵酶、發酵和純化工藝優化等方法，有望推動降低成本、高修飾水平的多種類型重組膠原蛋白的研發。多種新興技術的運用，有望進一步拓展重組膠原蛋白的構建和加工技術，同時降低生產成本。

總之，重組膠原蛋白以其優異的生物相容性、多功能性、可擴展性和品質可控等特性，是膠原蛋白家族的直接來源，尤其是生物相容性良好的新生物功能材料領域最大的來源之一。目前不同類型重組膠原蛋白的生產雖然受到表達體系、產量、成本等問題的制約，但未來隨著技術進步，重組膠原將為生物材料或生物醫學等領域提供臨床安全性高、多樣化、不同生物學功效的膠原蛋白原料。 

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